Khóa Học Nuôi Cấy Mô Tế Thực Vật

MỤC LỤC

Chương 1 Mở đầu ................................................................................................................ 3

1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 3

1.2. Yêu cầu của đề tài ..................................................................................................... 4

1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................... 4

Chương 2 Tổng quan tài liệu ............................................................................................... 5

2.1. Tổng quan về cây lan gấm ......................................................................................... 5

2.1.1. Nguồn gốc – phân loại ........................................................................................ 5

2.1.2. Đặc điểm sinh học .............................................................................................. 6

2.1.3. Khu vực phân bố ................................................................................................. 7

2.1.4. Giá trị dược liệu .................................................................................................. 7

2.1.5. Các nghiên cứu về cây lan gấm .......................................................................... 9

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro ............................................ 12

2.2.1. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi cấy ................................................ 12

2.2.2. Ảnh hưởng của các hệ thống bình nuôi cấy ..................................................... 13

2.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng trong nuôi cấy mô .................................................... 15

2.3. Hoạt tính kháng oxy hóa ở thực vật ........................................................................ 17

2.4. Hàm lượng phenolic trong thực vật ........................................................................ 17

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................................ 19

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 19

3.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 19

3.2.1.Nguồn mẫu ......................................................................................................... 19

3.2.2. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 19

3.2.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 19

3.2.3. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................... 20

3.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20

3.3.1.Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố liên quan đến quá trình phát triển

cây lan gấm ................................................................................................................. 21

3.3.1.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát hệ thống môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm .......................................................................... 21

3.3.1.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện chiếu sáng đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của cây lan gấm .......................................................................................... 22

3.3.2. Nội dung 2: Đánh giá chất lượng cây lan gấm trong quy trình khảo sát .......... 22

3.3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ................................................................. 23

3.3.2.2. Đánh giá hàm lượng phenolic ........................................................................ 24

3.4. Xử lí số liệu ............................................................................................................. 24

Chương 4 Kết quả và thảo luận ......................................................................................... 18

4.1. Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển

của cây lan gấm ................................................................................................... 24

4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

cây lan gấm ......................................................................................................... 24

4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của cây lan gấm từ quy trình nuôi cấy ....................... 24

Chương 5 Kêt luận và đề nghị ........................................................................................... 19

5.1.Kết luận ................................................................................................................. 19

5.1.Đề nghị .................................................................................................................. 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 20

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Trong muôn ngàn loài hoa đua hương khoe sắc mà thiên nhiên đã ban tặng cho

con người, hoa lan được người Châu Á liệt vào hàng “vương giả chi hoa” là vua của

các loài cây cỏ có hoa bởi vẻ đẹp đặc sắc muôn màu muôn vẻ, hương thơm nhẹ nhàng

nhưng cũng vô cùng quyến rũ. Bên cạnh giá trị đem lại về mặt tinh thần thì hoa lan

còn được làm nguồn nguyên liệu cho một số ngành sản xuất cụ thể như là nguồn

hương liệu cho sản xuất nước hoa, chất làm tăng hương vị thực phẩm, nguyên liệu để

điều chế keo, chất nhũ tương, chất thuộc da, ... . Một số loài lan còn được biết đến như

nguồn dược liệu có giá trị và nhiều tiềm năng. Đặc biệt, trong điều kiện hiện nay khi

mức sống người dân ngày một tăng lên thì nhu cầu sử dụng nguồn dược liệu nói

chung, lan dược liệu nói riêng vào công tác y dược để tăng cường sức khoẻ con người

càng được chú trọng.

Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng

tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa

các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng huyết áp, đau nhức khớp xương (Lin,

1993). Được coi là thần dược giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan,

tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ, rượu

lan gấm là tiên tửu có tác dụng hỗ trợ điều trị yếu sinh lý, hiếm muộn. Chính vì là cây

thuốc quý hiếm nên ngày xưa chỉ có vua chúa mới có điều kiện sử dụng. Hiện nay ở

Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore và Malaysia lan gấm được

các nhà giàu hay các bệnh nhân ung thư sử dụng hằng ngày giúp minh mẫn, tỉnh táo,

tinh thần phấn chấn để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống. Với đặc tính

quý giá về dược liệu, lan gấm tự nhiên được thị trường thu mua với giá khá cao, hơn

100.000.000 đồng/kg khô. Do số lượng ít, mọc rải rác và còn bị khai thác quá nhiều

(với hình thức khai thác lấy cả cây) lan gấm hiện đã trở nên giảm sút rõ rệt về số lượng

và có nguy cơ tuyệt chủng. Lan gấm đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 2007

theo Nghị định 32/2006/NĐ - CP và bị cấm khai thác sử dụng với mục đích thương

mại.

Đứng trước tình hình đó nền công nghiệp nuôi cấy mô nhân giống cây lan gấm

được phát triển để đáp ứng nhu cầu sử dụng của thị trường. Tuy nhiên trong quá trình

sinh trưởng và phát triển của lan gấm in vitro lại gặp khá nhiều khó khăn như điều kiện

nuôi cấy không phù hợp khiến chất lượng cây giống có thể bị biến dị như cây con nuôi

cấy mô có thể sai khác so với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết

quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Để góp phần tìm ra điều

kiện nuôi cấy phù hợp nhất cho việc phát triển và sinh trưởng của lan gấm, hỗ trợ sản

xuất công nghiệp và cũng là cơ sở khoa học phát triển hệ thống nuôi cấy lan gấm ở

quy mô lớn thì đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển

của cây lan gấm (Anoectochilus formosanus) in vitro” được thực hiện.

1.2. Yêu cầu của đề tài

1.2.1. Yêu cầu chung:

Khảo sát và tìm ra được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của

cây lan gấm.

1.2.2. Yêu cầu riêng:

 Xác định được hệ thống môi trường nuôi cấy rắn hoặc lỏng tốt nhất cho sự tăng

sinh của cây lan gấm.

 Xác định điều kiện chiếu sáng là đèn led hay ánh sáng huỳnh quang thì tốt cho sự

sinh trưởng của cây lan gấm.

1.3. Nội dung thực hiện

 Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống môi trường nuôi cấy trong quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm.

 Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống ánh sáng đến quá trình sinh trưởng và phát

triển của cây lan gấm.

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cây lan gấm

2.1.1. Nguồn gốc - phân loại

Lan gấm là một loại thảo mộc trên mặt đất với thân leo tạo ra những chiếc lá uốn

cong về phía ánh sáng. Lá có hình trứng, nhọn ở chóp, dài 3 - 4 cm và rộng 2 - 3 cm,

màu xanh đậm mặt trên và xanh tím ở mặt dưới, có vân trắng. Cuối chu kì sinh trưởng

cụm gấu hoa nở một vài bông hoa trắng có lông tơ ở đầu cánh hoa và kéo dài tới hết

hai thùy.

Lan gấm là một loại địa lan, được tìm thấy trong Phân họ Orchidoideae, phân

tông Goodyerinae với khoảng 35 chi và khoảng hơn 450 loài. Còn gọi là cây kim

cương, mộc sơn, thạch tùng, thuộc họ Orchidaceae gồm bốn chi:

Ludisia, Anoectochilus, Goodyera, Macodes và trên 50 loài (Ormerod Paul, 2005).

Trong đó chi Anoectochilus có số loài phong ph nhất và loài có giá trị dược liệu và

thương mại cao trên thế giới hiện nay là Anoectochilus formosanus Hayata. Trước đây

cây lan gấm trồng làm cây cảnh trong nhà, một số dân tộc thiểu số sử dụng lá lan gấm

chữa các vết thương do rắn độc cắn. Nhưng hơn một thập niên trở lại đây, Đài Loan

xem lan gấm là cây "Thuốc Vua" bởi tác dụng dược lý đa dạng của nó (Lin và Su,

1977).

Phân loại khoa học

Trong nghiên cứu này sử dụng lan gấm có tên khoa học là Anoectochilus

formosanus Hayata thuộc:

Giới

: Plante

Bộ

: Asparagales

Họ

: Orchidaceae

Chi

: Anoectochilus

Loài

: A. formosanus

Tên khoa học

: Anoectochilus formosanus Hayata

Hình 2.1 Cây lan gấm (Anoectochilus formosanus) Hayata

Nguồn: http://orchidspecies.com

2.1.2. Đặc điểm sinh học

Theo sách đỏ Việt Nam lan gấm là loại cây thân thảo mọc ở đất.

Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân

khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi

khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ

cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 4 - 10 rễ, trung bình là

5,9 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 10 cm, rễ dài nhất trung bình là 5,03 cm và

ngắn nhất trung bình là 0,96 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,47

cm.

Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều

dài thân khí sinh từ 4 - 6 cm, trung bình 5,4 cm. Đường kính thân khí sinh từ 2,5

- 3,5 cm, trung bình là 2,98 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài

khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2 - 4 lóng, trung bình là 3,6 lóng trên

thân. Chiều dài mỗi lóng từ 1 - 4 cm, trung bình 1,52 cm. Thân khí sinh thường mọng

nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng và đôi khi có màu hồng nhạt.

Số lượng lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6 lá, thông thường có 4 lá. Lá mọc cách

xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Kích thước của lá cũng thay đổi, thường dài từ 3 -

5 cm, trung bình là 3,75 cm và rộng của lá từ 2 - 4 cm, trung bình là 2,95 cm. Các lá

trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8 - 10

mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên

gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13 mm, có lông

thưa. Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất

chậm.

2.1.3. Khu vực phân bố

Lan gấm là một loài thảo dược rất quý hiếm của vùng núi Tây Bắc, chúng sinh

sống ở độ cao từ 800 - 1500m, mọc trong các khu rừng rậm, cây không phân bố ở

đồng bằng và thường mọc ở ven suối (nơi có độ ẩm cao) đặc tính ưa bóng mát nên chỉ

mọc dưới các tán cây rừng. Tại Việt Nam phân bố ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản

Bạ), Yên Bái, Vĩnh phc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức, Chùa Hương), Quảng Trị

(Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai (Kbang, Kon Hà Nừng).

Trên thế giới lan gấm là loài đặc hữu ở Đài Loan và cũng được tìm thấy tại các

đảo ngoài khơi của Lanyu. Nó cũng được tìm thấy trên quần đảo Ryukyu của Nhật

Bản và tỉnh Phúc Kitại Trung Quốc (Anon, 1999). Loài này còn được phát hiện ở

Srilanka, Malaysia, Ấn Độ, Nhật Bản, Australia và quần đảo Nam Thái Bình Dương,

(Liu; Su, 1978 và Teuscher, 1978).

2.1.4. Giá trị dược liệu

Các loài lan gấm đều quý. Loài thì cho giá trị rất cao trong thế giới sinh vật cảnh

rất nổi tiếng và có hình ảnh trên tất cả các tạp chí cây cảnh. Ở Việt Nam hiện nay

thống kê được khoảng hơn 15 loài trong đó chỉ có 2 loài là cây thuốc rất quý, một là

lan gấm ngọc vân bạc (Anoectochilus formosanus Hayata) và hai là lan gấm ngọc vân

hồng (Anoectochilus roxburghii).

Y học Trung Quốc dùng lan gấm làm mát máu, mịn gan, cũng như làm thuốc hạ

sốt và giải độc. Nó được sử dụng để điều trị bệnh nhân lao mắc bệnh tan máu, và cũng

để điều trị bệnh tiểu đường, viêm phế quản, nhiễm trùng thận và bàng quang, chuột rút

ở trẻ em, rắn cắn và đau dạ dày (Ou và ctv, 2003). Toàn bộ cây được sử dụng để điều

trị đau ở thắt lưng và đầu gối, tê, xuất huyết, phát ban đêm, viêm thận, tiết dịch âm đạo

và co giật ảnh hưởng đến trẻ em (Wu, 1994; Hu và ctv, 2000).

Lan gấm có khả năng kháng virus, kháng viêm và bảo vệ gan. Chiết xuất của

cây A. formosanus khô có chứa 4 - hydroxycinnamic acid, β - sitosterol, β - D -

glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid (Takatsuki và ctv, 1992). Gần đây,

một hợp chất 3(R) - 3 - β - D - glucopyranosyloxy butanolide tên thương mại là

kinsenoside được chiết xuất từ A. formosanus và A. koshunensis chống tăng huyết áp

hiệu quả (Takeshita, 1995; Mak, 1990; Lin, 1993; Chan, 1994; Du, 1998). Dịch chiết

từ A. formosanus có tác dụng kích thích hệ miễn dịch (Lin và Hsieh, 2005) và cũng

như bảo vệ gan (Wu và ctv, 2007). Masuda và ctv (2008) đã cho thấy chất chiết xuất

từ dung dịch của A. formosanus có khả năng chặn loãng xương do thiếu estrogen.

Lan gấm A. formosanus là một thành phần trong những bài thuốc cổ của đồng

bào người dân tộc vùng Tây Bắc. Những nguồn tài liệu về y học của Trung Quốc cho

thấy cây lan gấm là vị thuốc được xem là rất quý. Theo dược điển của Trung Quốc thì

cây lan gấm có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông. Cây thuốc có

tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính. Toàn thân cây

thuốc đều có thể chữa bệnh, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ

và các vết thương do rắn cắn còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt. Lan gấm có vị ngọt,

tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, thanh huyết, bổ phổi, giải trừ u uất, thông trung khí,

bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ

huyết, ho hen, đau ngực, đau lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn,

suy thận. Giúp hạ sốt, giải nhiệt, giải trừ u uất phiền muộn, trị ho khan, đau ngực, đau

họng, sắc uống với nước đường. Người dân tộc miền núi (Trung Quốc) thường dùng

lan gấm sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị các vết sưng

và chỗ bị rắn cắn. Ngoài ra lan gấm còn có tác dụng thanh huyết, nhuận phổi, trị bệnh

phổi. Lan gấm 20 phân, sắc uống với nước đường, có tác dụng thanh huyết, trị bệnh

cao huyết áp. Lan gấm sử dụng làm thuốc là toàn bộ cây tươi hay cây khô sắc uống.

Sử dụng đắp ngoài thì lấy toàn bộ cây tươi rửa sạch, giã nát đắp vào nơi sưng đau như

là một loài thảo mộc trị rắn cắn (Kan, 1986).

2.1.5. Các nghiên cứu về cây lan gấm

Y học hiện đại công nhận lan gấm là cây thuốc quý - khắc tinh bệnh ung thư và

được đăng nhiều bài nghiên cứu trên các tạp chí có uy tín cũng như được cấp bằng

sáng chế. Gần đây, thêm nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh được giá trị vô cùng

quý của lan gấm.

Tại Việt Nam

Năm 2015, Đỗ Mạnh Cường và ctv đã có bài nghiên cứu về “Ảnh hưởng của một

số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm (Anoectochilus

setaceus Blume) nuôi cấy in vitro” và kết quả cho thấy quá trình sinh trưởng và phát

triển của các đốt thân mang chồi ngủ của cây lan gấm tốt nhất trên môi trường SH lỏng

có bông gòn bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA. Các chồi lan gấm khỏe, có hệ rễ

phát triển mạnh và không còn bị hiện tượng nâu hóa, đây là những yếu tố quan trọng

trong việc hoàn thiện quy trình nhân giống cây lan gấm.

Năm 2016, TS. Đỗ Đăng Giáp đã hoàn thành qui trình sản xuất sinh khối cây

dược liệu lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata). Kết quả cho thấy cao chiết

methanol ở nồng độ 100 mg/ml có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn

Salmonela typhimuricum và ở nồng độ 500 mg/ml thì cả bốn chủng vi khuẩn đều bị ức

chế tăng trưởng (B. subtilis, P. aeruginosa, Salmonela typhiumricum, S. aureus), với

kích thước vòng kháng khuẩn lần lượt là 13,5; 20,5; 30; 12,5. Kết quả còn cho thấy

khả năng kháng khuẩn gram âm (P. aeruginosa, Salmonella typhimuricum) của cao

chiết methanol cây lan gấm cao hơn khả năng kháng khuẩn gram dương (B. subtilis, S.

aureus). Kết quả trên cũng chỉ ra rằng trong lan gấm có hoạt chất có thể sử dụng nhằm

kiểm soát hoạt động của một số vi khuẩn gây bệnh ở người. Vì thế, các kết quả thu

được ở đề tài này đã củng cố thêm cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn khi khảo sát

tiếp tục các hoạt tính kháng khuẩn của cây lan gấm. Kết quả đề tài này cho thấy có thể

ứng dụng phương pháp nuôi cấy in vitro cho việc tạo sinh khối sạch cây lan gấm để

làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.

Năm 2017, Phan Xuân Hiên và Nguyễn Thị Phượng Hoàng đã hoàn thành quá

trình nghiên cứu tái sinh chồi in vitro và nuôi trồng cây lan gấm Anoectochilus

formosanus Hayata. Trong nghiên cứu tái sinh chồi và rễ in vitro, môi trường MS bổ

sung 1 mg/L BA, 50 g/L chuối, 30 g/L sucrose, 1 g/L than hoạt tính, 9 g/L agar, pH 5

là tốt nhất cho sự tái sinh chồi. Mẫu mang một đốt thân là nguồn vật liệu thích hợp

nhất trong nhân giống với vị trí từ đốt thứ 2 đến đốt thứ 6 là thích hợp nhất. Nồng độ

IBA từ 0 - 1 mg/L đều thích hợp cho sự tái sinh rễ. Trong nuôi trồng cây lan gấm, giá

thể vụn xơ dừa thích hợp hơn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm với giá thể 50 %

vụn xơ dừa phối trộn 50 % đất mùn. Phun phân bón lá Nitrophoska với nồng độ 2 g/L

tốt hơn nồng độ 1 g/L. Giá thể dớn mút trồng cây tốt hơn giá thể vụn xơ dừa.

Năm 2018, ThS. Đỗ Đức Thăng đã nghiên cứu điều kiện nuôi cấy nhân nhanh

sinh khối cây lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) trong Bioreactor. Nghiên

cứu này đã xác định được ảnh ưởng của 4 loại hợp chất hữu cơ bổ sung vào môi

trường Albert’s và các điều kiện nuôi cấy cho sự gia tăng sinh khối cây lan gấm trong

bioreactor. Nồng độ sinh khối tảo Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi cấy

9,0 g/L cho sự gia tăng sinh khối cây lan gấm tốt nhất đạt hệ số nhân là 6,8 lần. Casein

hydrolysate bổ sung vào môi trường nuôi cấy sinh khối cây lan gấm với nồng độ 1

hoặc 3 g/L có hệ số nhân đạt lần lượt là 5,3 và 5,6 lần. Môi trường sinh khối cây lan

gấm bổ sung peptone với nồng độ 1 g/L có tác động tích cự lên sự gia tăng sinh khối

lan gấm với hệ số nhân là 4,4 lần. Cao nấm men bổ sung vào môi trường nuôi cấy sinh

khối cây lan gấm với nồng độ 1 g/L hỗ trợ sự gia tăng sinh khối cây lan gấm đạt hệ số

nhân là 4,2 lần. pH tối ưu cho sự phát triển của cây lan gấm là pH 5,8 cho sự gia tăng

khối lượng đạt 4,9 lần sau 8 tuần nuôi cấy. Lưu lượng sục khí thích hợp để nuôi cấy

sinh khối cây lan gấm trong biorector là 4 L/phút sinh khối với hệ số nhân là 5,2 lần.

Mật độ mẫu cấy tối ưu cho sự nhân nhanh sinh khối trong biorector là 10 g/500mL

môi trường đạt hệ số nhân là 5,0 sau 8 tuần nuôi cấy. Chu kì chiếu sáng cho quá trình

nuôi cấy sinh khối cây lan gấm trong biorector là 12 giờ /ngày, sinh khối gia tăng 6,0

lần.

Trên thế giới

Năm 2002, Shiau Y.J và cộng sự tìm ra phương án bảo tồn Anoectochilus

formosanus Hayata bằng cách thụ phấn chéo và phát triển hệ thống nhân giống invitro

nhanh chóng cho A. formosanus Hayata không chỉ giúp bảo tồn tế bào mầm mà còn

gip tăng sinh khối cây lan gấm cho nhu cầu thị trường. Kết luận quy trình tối ưu để

sản xuất cây nhanh ở A. formosanus sử dụng từ hạt giống được tóm tắt như sau: Sử

dụng hoa A. fomosanus thu được từ môi trường sống tự nhiên hoặc trong điều kiện

nuôi trường được kiểm soát. Khoảng thời gian từ 2 đến 4 ngày sau khi ra hoa là tối ưu

cho thụ phấn chéo nhân tạo. Hạt từ 7 tuần tuổi khi nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS

với than hoạt tính 0,2 % và 8 % dịch chuối đồng nhất cho thấy tỷ lệ nảy mầm cao

(77,9 %) và thân rễ và chồi phát triển tốt. Cây con nuôi cấy trong môi trường 1/2 MS

lỏng chứa 2 mg/l BA trong hai tháng. Sau đó chọn cây phát triển nuôi cấy trên môi

trường 1/2 MS với 0,2 % than hoạt tính, 8 % dịch chuối đồng nhất, 0,2 mg/l BA và 0,5

mg/l NAA trong hai tháng để tăng trưởng hơn nữa. 90 % cây con sống sót chuyển sang

môi trường hỗn hợp rêu than bùn + đá vermiculite và ủ trong buồng tăng trưởng. Với

các phương pháp được trình bày ở đây, có thể tạo ra những cây A. formosanus khỏe

mạnh, không bệnh, sau đó có thể được đưa đến môi trường sống của chng như công

viên quốc gia.

Năm 2017, Chung H.H và cộng sự phát hiện mới về các đặc tính nông học và các

thành phần dược liệu của số nhiễm sắc thể trong Anoectochilus formosanus Hayata,

một loại lan dược liệu hàng đầu. Nghiên cứu này đã phát triển một hệ thống hiệu quả

và đáng tin cậy để tạo ra thể đa bội trong Anoectochilus formosanus Hayata. Cây tứ

bội tạo ra hàm lượng flavonoid và gastrodin cao hơn đáng kể trong lá, thân và toàn bộ

cây khi so sánh với cây lưỡng bội. Trong các phương pháp nghiên cứu colchicine thì

100 mg/l colchicine cộng với 0,5 mg/l TDZ cho số chồi sống sót cao nhất (khoảng

8,3/lần) và tỷ lệ đa bội cao nhất (50 %). Về đặc điểm nông học, cây tứ bội có hiệu ứng

cao hơn đáng kể trong hiệu suất tăng trưởng. Hình dạng lá đã bị thay đổi đáng kể bởi

mức độ nhiễm sắc thể và cây tứ bội có lá dây thay vì lá hình trứng như lưỡng bội

thông thường. Khi được cấy vào chậu cây tứ bội vẫn duy trì hiệu suất tăng trưởng tốt

hơn so với cây lưỡng bội. Ngoài ra cây tứ bội có tổng hàm lượng gastrodin cao hơn

đáng kể trong toàn bộ cây.

Năm 2018, Ho và cộng sự nghiên cứu về tác dụng ức chế của chiết xuất

Anoectochilus formosanus đối với biểu hiện PD - L1 liên quan đến tăng đường huyết

và tăng sinh tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này, chng tôi đã đánh giá tác dụng hạ

đường huyết của chiết xuất A. formosanus (AFEs). AFE làm giảm đường huyết ở

chuột và diện đường cong phản ứng đường huyết đã giảm đáng kể. AFE và metformin

(loại thuốc đầu tiên chống bệnh đái tháo đường) với cùng liều 50 mg/kg cho thấy hiệu

quả tương tự đối với xét nghiệm dung nạp glucose trong màng bụng ở chuột bị tăng

đường huyết. Khả năng quét gốc tự do của AFE phụ thuộc vào nồng độ và 200 μg/ml

AFE có thể làm giảm hơn 41 % gốc tự do. Điều trị các tế bào ung thư bằng AFE gây

ức chế sự biểu hiện PD-L1 và tích lũy protein của nó. Nó cũng gây ra sự biểu hiện của

các gen pro-apoptotic nhưng ức chế các gen tăng sinh và di căn. Ngoài ra, nó gây ra

chống tăng sinh trong các tế bào ung thư. Kết quả cho thấy AFE không chỉ làm giảm

nồng độ glucose trong máu như metformin mà còn cho thấy tiềm năng sử dụng của nó

trong điều trị, hóa trị liệu miễn dịch ung thư thông qua tác dụng hạ đường huyết và ức

chế PD - L1.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro

2.2.1. Ảnh hưởng của trạng thái bình nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, điều kiện nuôi cấy đóng một vai trò hết sức

quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy, có thể nói môi

trường nuôi cấy được bổ sung thêm các chất tăng trưởng cho cây và các chất điều hòa

sinh trưởng để thay thế cho phần đất ở môi trường bên ngoài. Môi trường nuôi cấy có

nhiều trạng thái và mỗi trạng thái môi trường sẽ có những ảnh hưởng khác nhau tới sự

hấp thu chất dinh dưỡng cũng như sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro.

Cơ chế của sự thay đổi các yếu tố của môi trường trong bình nuôi cấy tương tự

như trong nhà kính. Một bình nuôi cấy có thể được xem như một nhà kính thu nhỏ hay

một phòng sinh trưởng của mẫu cấy (Read, 1990).

Môi trường thạch Agar

Agar có dạng bột màu trắng hay vàng nhạt, không mùi hay có mùi nhẹ đặc trưng,

không vị, không ảnh hưởng đến nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi

cấy. Agar được ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật, động vật bởi đặc tính tạo gel của

nó. Trong nuôi cấy mô thực vật, môi trường nuôi cấy mô được xem là yếu tố quan

trọng bậc nhất, đóng vai trò quyết định cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro. Và

chất làm đông Agar pha môi trường giúp cố định vật mẫu và cung cấp dinh dưỡng tốt

hơn cho cây phát triển. Agar tạo giá đỡ cây nhưng có thể làm giảm sự tiếp xúc của

mẫu cấy với chất dinh dưỡng trong quá trình hấp thu dinh dưỡng (Dương Công Kiên,

2003). Hơn nữa lực khuếch tán của cation trong môi trường có agar thấp nên mẫu cấy

chỉ có thể sử dụng một phần chất dinh dưỡng đưa vào môi trường.

Môi trường lỏng

Mẫu cấy dễ bị ngập trong môi trường dẫn đến việc thiếu O2 có thể làm cho mẫu

chết hàng loạt (trừ những loại mẫu cây đã có sẵn đặc tính thích nghi tốt trong môi

trường lỏng ví dụ như sâm Ngọc Linh). Tuy nhiên mẫu cấy lại có thể hấp thu nhiều

dưỡng chất trong môi trường lỏng tĩnh một cách nhanh nhất. Nuôi cấy trong môi

trường lỏng tĩnh có hiệu quả hơn về chi phí vì không cần phải có thêm agar. Hơn nữa

mẫu cấy được bao phủ hoàn toàn bởi môi trường, tất cả các tế bào có cơ hội hấp thụ

chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật trực tiếp từ môi trường. Ngoài

ra, môi trường có thể được thay đổi tự động để bổ sung các chất dinh dưỡng đã cạn

kiệt, loại bỏ các chất chuyển hóa độc hại, chuyển đổi giữa các giai đoạn phát triển sinh

lý nếu sử dụng phản ứng sinh học (Moorhouse và ctv, 1996). Môi trường nuôi cấy

lỏng cho phép phân phối đồng đều chất dinh dưỡng và các chất điều hòa tăng trưởng,

do đó không có vùng suy giảm (độ dốc) được hình thành xung quanh mẫu cấy. Đây là

lợi thế vì tác dụng của các chất điều chỉnh tăng trưởng được giữ nguyên nồng độ. Nói

chung, nuôi cấy lỏng thể hiện sự tăng trưởng cao hơn so với nuôi cấytrên môi trường

rắn thông thường.

2.2.2. Ảnh hưởng của các hệ thống bình nuôi cấy

Là một trong những dụng cụ không thể thiếu trong phòng thí nghiệm, đây là

dụng cụ chứa môi trường để nuôi cấy mô, vi sinh hiệu quả. Hệ thống nuôi cấy được

cải tiến không ngừng để thuận tiện cho việc sử dụng và nâng cao chất lượng cây nuôi

cấy mô. Năm 1897, lần đầu tiên Loeb đã sử dụng hệ thống nuôi cấy bằng ống nghiệm

(test tube) tuy nhiên hệ thống nuôi cấy này còn nhiều nhược điểm. Sau này nhiều hệ

thống nuôi cấy được thử nghiệm. Hiện nay trong các phòng nuôi cấy mô trên thế giới

việc sử dụng bình nuôi cấy bằng nhựa hay film nylon đã rất phổ biến, thay thế dần các

bình nuôi cấy bằng thủy tinh. Tuy nhiên mỗi loại lại có ảnh hưởng khác nhau cũng như

sẽ có những ưu nhược điểm phù hợp cho từng đối tượng nuôi cấy in vitro.

Dạng bình nuôi cấy khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến sự phát triển của cây,

với sự phát triển của Công nghệ Sinh học ngày nay vật liệu nuôi cấy được ưu tiên nhất

vẫn là các loại bình có thời gian sử dụng lâu dài, mức độ truyền sáng tốt để cung cấp

đủ ánh sáng cho mẫu cấy phát triển. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng hệ

thống nuôi cấy thoáng khí có nhiều đặc điểm thuận lợi hơn so với các hệ thống nuôi

cấy truyền thống. Trong đó vật liệu thoáng khí polymer được sử dụng để tạo các hệ

thống dạng hộp và hệ thống dạng túi (Tanaka, 1998) trong nuôi cấy tĩnh. Người ta

cũng có thể tạo hệ thống nuôi cấy thoáng khí bằng cách gắn màng lọc không khí lên

nắp hay thành hộp nuôi cấy, đây là phương pháp đơn giản để gia tăng nồng độ CO2

trong hộp nuôi cấy (Kozai và ctv, 1992).

Bình thủy tinh

Trong nuôi cấy mô, chai thủy tinh được xem là phương pháp tối ưu nhất để

chống nhiễm khuẩn, đối lưu không khí dễ dàng cho cây. Với bề mặt thuỷ tinh có độ

trong suốt cao giúp cây có thể hấp thu hầu hết ánh sáng từ môi trường bên ngoài, độ

truyền sáng tốt. Bề mặt thuỷ tinh ít bị rỗ khi soi dưới kính hiển vi, giúp quá trình vệ

sinh chai dễ dàng hơn, dễ chùi rửa, hạn chế tối đa khả năng bám dính các bào tử nấm,

giảm khả năng nhiễm sau nhiều lần sử dụng, tối ưu kết quả nuôi cấy. Quan trọng hơn

hết, chai thuỷ tinh nuôi cấy mô có ưu điểm là sử dụng lâu dài, có thể tái sử dụng nhiều

lần thay vì sử dụng túi nilon hay hộp nhựa dùng một lần để nuôi cấy mô. Hầu hết trên

thị trường hiện nay đều sử dụng chai nước biển hay chai rượu khi nhân giống lan. Điều

này dẫn đến việc muốn lấy cây đã lớn để cho ra chậu rất khó khăn, hoặc phải kéo cây

ra hoặc phải đập bể chai. Nếu kéo cây lan trong giai đoạn này không khéo sẽ làm cho

Lan bị tổn thương, còn nếu đập bể chai thuỷ tinh thì rất nguy hiểm cho người thu dọn

rác và tổn hại đến môi trường. Ngoài ra còn dễ vỡ và chiếm nhiều diện tích.

Hộp nhựa

Nhựa có khả năng đàn hồi và có khả năng hấp thụ sốc hơn khi bị va đập hoặc rơi

xuống mang lại lợi ích an toàn hơn cho các nhà khoa học, giảm khả năng mất mẫu có

giá trị và giảm chi phí cho việc thay thế bình chứa mẫu. Nhựa hiện là một sự thay thế

khá tốt cho thủy tinh trong các hệ thống nuôi cấy in vitro, nhất là khả năng phục hồi

của chúng khi rơi vỡ. Các loại nhựa tiên tiến hơn không gây độc đối với tế bào sống

hiện đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm. Trong nhiều trường hợp, các loại

nhựa tiên tiến mới này là lựa chọn ưu tiên so với thủy tinh. Có 2 loại hộp nhựa vuông

và hộp nhựa tròn. Hộp nhựa có độ bền cao, hạn chế các vết rạn nứt, không gian bên

trong hộp rộng, dễ thao tác, dễ chùi rửa tiện lợi hơn rất nhiều và có thể xếp thành

chồng cao, tiết kiệm diện tích. Khoảng không gian trong hộp lớn tạo điều kiện cho

mẫu phát triển tốt. Tuy nhiên hộp nhựa lại không dùng được lâu dài vì chất lượng nhựa

bị giảm sút trở nên đục dẫn tới sự truyền ánh sáng kém và ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng của cây trồng. Hộp dễ lão hóa chỉ qua 3 - 4 lần hấp khử trùng bằng autoclave.

Bịch nylon

Là một loại polymer có tính bền vững nhất về mặt hóa học, đặc biệt là bền nhiệt.

so với những loại vật liệu khác thì nylon có tính năng vượt trội hơn hẳn như trơ về mặt

hóa học, có độ nóng chảy cao từ 265 – 310 oC. Do đó nylon có thể khử trùng trong nồi

áp suất ở nhiệt cao nhưng vẫn an toàn. Khả năng truyền khí O2, N2 và CO2 tốt hơn các

vật liệu khác. Nylon đáp ứng được các đặc điểm cần thiết của hệ thống nuôi cấy mô

thực vật như khả năng bay hơi nước thấp, độ truyền ánh sáng giống như thủy tinh. Giá

thành rẻ, không gian bên trong túi vừa đủ cho sự trao đổi khí của cây. Polyethylene là

một trong những polymer ổn định do đó hệ thống nuôi cấy bằng túi nylon sử dụng vật

liệu là polyethylene (PE) đã được ứng dụng (Nhut, 2000) nhằm giảm giá thành hệ

thống nuôi cấy mà vẫn giữ được ưu điểm. Trong quá trình sản xuất và vận chuyển mẫu

cây, bịch nylon đã thể hiện tính năng tiện dụng của nó khi không cần phải thu hồi lại

bình chứa lại như bình thủy tinh hay hộp nhựa. Giảm rất nhiều chi phí trong quá trình

vận chuyển.

2.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng trong nuôi cấy mô

Ánh sáng giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lí như sự nảy mầm

của hạt và sự phát triển của chồi. Có vai trò quyết định tác động đến quá trình sinh

trưởng của cây giống như điều khiển sự ra hoa, sự thoát hơi nước, quá trình hô hấp,

quá trình thẩm thấu, tính quang hướng động và hoạt động của enzyme ở thực vật. Đối

với cây nuôi cấy mô, ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp,

điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái ở thực vật và biểu hiện gen (Ma, 2001). Thông

thường sự sinh trưởng của cây bị ảnh hưởng bởi chất lượng ánh sáng, thời gian chiếu

sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh và các tác động cơ học

(Schwabe, 1963; Salisburi, 1981). Trong số các yếu tố trên, điều kiện chiếu sáng có tác

động mạnh mẽ lên sự kéo dài thân cây.

Với sự phát triển của xã hội loài người, nguồn sáng nhân tạo đã được ra đời. với

sự phát minh bóng đèn điện đầu tiên Thomas Edison vào năm 1879, ánh sáng nhân tạo

đã đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển tri thức và công nghệ. Kể từ khi ra

đời, bóng đèn sợi đốt không ngừng được cải thiện để tăng chất lượng chiếu sáng nhằm

phục vụ tốt hơn nhu cầu đời sống con người và nông nghiệp trong đó có lĩnh vực vi

nhân giống. Bóng đèn huỳnh quang là nguồn sáng được sử dụng phổ biến trong nuôi

cấy thực vật in vitro.

Hiện nay ánh sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy mô chủ yếu là cung cấp bởi

đèn huỳnh quang với chấn lưu sắt từ nên tỏa nhiệt nóng và hao tốn điện năng. Vấn đề

đặt ra là cần nghiên cứu xây dựng những giải pháp chiếu sáng khoa học, hiệu quả, vừa

đảm bảo yêu cầu tiết kiệm điện vừa đảm bảo sự sinh trưởng, phát triển và hệ số nhân

của cây nhân giống gip nâng cao năng suất, hiệu quả kinh tế. Và đèn LED đã góp tên

mình vào danh sách sản phẩm chiếu sáng hữu hiệu trong nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào.

Đèn LED có ưu điểm là có bước sóng xác định, phát ra ánh sáng màu đơn sắc, hiệu

quả cao, sinh nhiệt thấp, tuổi thọ lâu dài và tiết kiệm năng lượng. Với kích thước và

thể tích nhỏ, tuổi thọ cao và vùng quang phổ được kiểm soát, đèn LED là nguồn chiếu

sáng chính trong nuôi cấy in vitro.

Với mỗi phương pháp nuôi cấy in vitro, mỗi loại đối tượng nuôi cấy, mỗi giai

đoạn sinh trưởng lại cần mức độ chiếu sáng khác nhau nhằm cung cấp đủ lượng ánh

sáng cho cây quang hợp. Trái với mắt người có phổ nhạy cảm tối đa ở bước sóng

555nm, phổ hấp thụ diệp lục của cây chủ yếu tập trung ở 2 vùng ánh sáng màu đỏ có

phổ (600 nm - 700 nm) và vùng ánh sáng màu xanh có phổ (400 nm - 500 nm). Ở

những bước sóng này quang phổ của đèn LED tạo ra có bước sóng gần trùng với

quang phổ hấp thụ của diệp lục tố trong cây trồng. Do vậy việc sử dụng nguồn sáng

thông thường (đèn huỳnh quang) trong chiếu sáng phòng nuôi cấy mô hiện nay không

phải là giải pháp tối ưu gip cây sinh trưởng tốt.

Cường độ ánh sáng được truyền xuống bình nuôi cấy phụ thuộc vào loại và năng

lượng của nguồn sáng, vật liệu và hình thái của bình nuôi cấy, vị trí của nguồn sáng có

hoặc không có vật phản xạ, đặc điểm phản xạ quang học của hệ thống nuôi cấy

(Fujiwara, 1989). Trong nuôi cấy mô, khoảng cách giữa nguồn sáng và bình nuôi cấy

thường là 30 - 40 cm. Nguồn chiếu sáng không những cung cấp ánh sáng cho hệ thống

nuôi cấy mà còn phải thỏa mãn tiêu chí tiết kiệm điện và không tăng nhiệt độ phòng

nuôi cấy (Fujiwara và Kozai, 1995).

2.3. Hàm lượng phenolic trong thực vật

Hợp chất phenolic là nhóm các chợp chất hóa học mà trong phân tử có chứa

nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydro cacbon thơm. Chng rất phổ biến và

được phân bố rộng rãi trong giới thực vật, là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của

thực vật. Các hợp chất phenolic rất đa dạng về cấu trc (hơn 8000 cấu trúc phenolic

được tìm thấy). Phần lớn các hợp chất này dễ hòa tan do có các nhóm -OH, các phân

tử nhỏ hơn dễ bay hơi. Các hợp chất có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có thành

phần cấu trúc chung nên chúng có một số tính chất như phản ứng phá vòng benzen,

phản ứng tạo phức với kim loại, phản ứng của nhóm hydroxyl và phản ứng este hóa.

Các tác dụng của phenolic đối với sức khỏe hầu như đều liên quan đến tính

chất chống oxy hóa của chúng. Các chất chống oxy hóa được xem là có khả năng ngăn

chặn tổn thương xảy ra ở tế bào. Phenolic là một trong những hoạt chất tự nhiên có

nhiều tác dụng như chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng và chống

lão hóa cho con người. Là một trong các chất chống oxy hóa tự nhiên thu hút sự quan

tâm của nhiều nhà khoa học (Ahmed, 2005). Phenolic phòng chống được các bệnh tim

nhờ khả năng ức chế sự sản sinh Endothelin (một loại protein gây co mạch máu, làm

giảm khả năng oxy tới tim và gây ra bệnh mạch vành) (Reiter và ctv, 2010). Ngoài

hoạt tính chống oxy hóa, các hợp chất phenolic từ các cây khác nhau đã được báo cáo

là có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Megdiche-

Ksouri và ctv, 2015). Nhiều kết quả thử nghiệm cho thấy chế độ ăn giàu polyphenol sẽ

làm hạn chế sự xuất hiện stress oxi hóa và nhiều bệnh liên quan (Yang và ctv, 2001;

Breene, 1990). Hơn thế nữa, polyphenol còn có khả năng bảo quản thực phẩm. Việc

kiểm tra các hợp chất tự nhiên ở thực vật đối với khả năng chống oxy hóa đã trở nên

quan trọng vì tính ứng dụng trong điều trị bệnh và sự gia tăng đáng báo động của vi

sinh vật gây bệnh kháng lại kháng sinh hiện có trong những năm gần đây. Ngoài ra,

nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy, tổng hàm lượng polyphenol có liên quan đến các

hoạt tính sinh học, nhất là hoạt tính kháng oxy hóa.

Tuy nhiên, những người bị dị ứng với thực phẩm thường mắc phải một vài bệnh

có thể cần kiêng một số thực phẩm giàu phenolic. Bên cạnh những tác dụng của

polyphenol đối với sức khỏe, tiêu thụ quá mức hợp chất này cũng có khả năng gây ra

tác dụng không mong muốn. Một số thực phẩm chức năng bổ sung phenolic với hàm

lượng cao hơn nhu cầu cần thiết trong một chế độ ăn uống lành mạnh. Có thể thấy

trong chế độ ăn uống lành mạnh và an toàn không thể thiếu những thực phẩm giàu

phenolic. Nhìn chung, việc bổ sung phenolic cho cơ thể tốt nhất là thông qua các thực

phẩm tự nhiên thay vì dùng thực phẩm chức năng.

2.4. Hoạt tính kháng oxy hóa ở thực vật

Hoạt tính kháng oxy hóa là một trong những hoạt tính sinh học quan trọng được

xem xét phổ biến nhất trên khía cạnh sử dụng thực phẩm hay dược liệu để phòng

bệnh và chữa bệnh. Các dạng oxy hoạt động, bao gồm các gốc tự do và các ion chứa

oxy có hoạt tính oxy hóa cao như -OH, -HOO, -O2 các chất này được định nghĩa như là

một phân tử có chứa các electron đơn lẻ và chúng cần một electron khác kết hợp thì

mới không gây độc cho cơ thể. Các chất này có năng lượng cao và kém bền nên phản

ứng rất nhanh với các phân tử bao quanh nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi

giá trị sinh học của các đại phân tử sih học như ADN, lipid, protein gây biến dị, huỷ

hoại tế bào, gây ung thư, các bệnh tim mạch, tiểu đường, béo phì và tăng nhanh sự

lão hoá (Favier A, 2003). Vì vậy, việc bổ sung các chất chống oxy hóa để kiểm soát

hàm lượng ổn định và giúp trung hòa các gốc tự do mang lại nhiều lợi ích tốt cho cơ

thể như bảo vệ sự toàn vẹn của tế bào, ngăn ngừa được một số tai biến, làm chậm

quá trình lão hoá cơ thể, bảo vệ chức năng gan, hạn chế các tác nhân gây viêm, bảo

vệ chức năng của hệ thần kinh, giảm thiểu các tác nhân gây ung thư, điều trị bệnh

Alzheimer, Parkinson và tạo sự ổn định của cơ thể.

Trong tự nhiên có hàng ngàn chất chống oxy hóa. Nhiều nghiên cứu chứng minh

rằng chất chống oxy hóa có nhiều trong thực phẩm hàng ngày, các loại rau quả, hạt

và một số loại đồ uống. Trong đó rau của là nguồn thực phẩm dồi dào chất chống oxy

hóa. Nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật đặc biệt trong các cây dược liệu là

Flavonoid. Những Flavonoid có hoạt tính sinh học được gọi là Bioflavonoid. Một

trong các hoạt tính sinh học nổi trội của Bioflavonoid là tác dụng chống oxy hóa.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2019 – 7/2020 tại phòng thí nghiệm trọng điểm

phía Nam về Công nghệ Tế bào Thực Vật, Viện Sinh học Nhiệt Đới.

3.2. Vật liệu nghiên cứu

3.2.1. Nguồn mẫu

Nguồn mẫu dùng cho các thí nghiệm là mẫu cây lan gấm A. formosanus in vitro

tại phòng công nghệ tế bào thực vật viện Sinh học nhiệt đới.

3.2.2. Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 23 - 27oC, điều kiện chiếu sáng 14 h/ngày (trừ thí

nghiệm khảo sát thời gian chiếu sáng), cường độ ánh sáng 45 μmol m-2 s-1 và độ ẩm

phòng nuôi cấy: 55 - 60%.

3.2.3. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ:

Bình thủy tinh, hộp nhựa sigma, bịch ni lông, kẹp cấy, đèn cồn, kéo, kẹp giấy,

dao cắt và ống nghiệm.

Thiết bị:

Hệ thống đèn huỳnh quang và máy lạnh, hệ thống đèn led (50 % led xanh + 50 %

led đỏ) và máy lạnh, tủ cấy vô trùng, nồi hấp Autoclave, phòng nuôi cấy được trang bị

hệ thống đèn huỳnh quang (Philips), máy đo diện tích lá (), máy do OD (), máy đánh

sóng âm (), thiết bị cô quay (), máy sấy và máy lạnh (Daikin), cân phân tích và một số

thiết bị khác dùng trong phòng thí nghiệm.

3.2.4. Môi trường nuôi cấy

Hóa chất:

Các hợp chất pha môi trường MS, Agar, than hoạt tính, methanol, acetone 80 %,

cồn 70o, cồn 96o.

Môi trường nuôi cấy sử dụng trong các phòng thí nghiệm là môi trường MS

(Murashige và Skoog, 1962) kết hợp 10 % nước dừa, 30 g/l đường sucrose, 0,4 g/l

than hoạt tính, 7,5 g/l agar (tùy thuộc vào nghiệm thức). Môi trường sẽ được điều

chỉnh pH 5,7 - 5,8. Sau đó hấp khử trùng ở 121oC và 20 phút.

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố liên quan đến sự phát triển cây

lan gấm

3.3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát hệ thống môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm.

Mục tiêu: Xác định được hệ thống môi trường tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của cây

lan gấm nuôi cấy in vitro.

Cách tiến hành: Chồi cây lan gấm cao 3 cm được nuôi cấy trong hệ thống các loại vật

liệu nuôi cấy: bình thủy tinh, bịch nylon, hộp nhựa sigma. Mỗi đơn vị hệ thống vật liệu

nuôi cấy chứa 50 ml môi trường nuôi cấy MS. Mỗi đơn vị nuôi vị nuôi cấy cấy 5 mẫu.

Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hai yếu tố và được lặp lại 3 lần.

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm

Trạng thái môi trường

(yếu tố B)

Hình thái bình nuôi cấy (yếu tố A)

Bịch nylon

Bình thủy tinh

Hộp nhựa sigma

Rắn

NT1

NT2

NT3

Lỏng

NT4

NT5

NT6

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự tăng trưởng thông qua khối lượng tươi (g), khối lượng

khô (g), chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), hàm lượng chlorophyll (mg/g).

Thời gian theo dõi: 8 tuần.

3.3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện chiếu sáng đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của cây lan gấm.

Mục tiêu: Xác định được hệ thống ánh sáng tối ưu nhất cho sự sinh trưởng và phát

triển của cây lan gấm.

Cách tiến hành: Chồi cây lan gấm cao 3 cm được cấy vào hệ thống nuôi cấy với thệ

thống môi trường tối ưu nhất ở thí nghiệm 1. Môi trường sử dụng là môi trường MS.

Thí nghiệm được nuôi cấy ở hai điều kiện chiếu sáng là ánh sáng đèn huỳnh quang và

ánh sáng đèn LED. Mỗi đơn vị nuôi cấy cấy 5 mẫu. Thí nghiệm thực hiện theo kiểu

đơn yếu tố và được lặp lại 3 lần.

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm

Đèn huỳnh quang

Đèn led

TN7

TN8

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự tăng trưởng thông qua khối lượng tươi (g), khối lượng

khô (g), chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), hàm lượng chlorophyll (mg/g).

Thời gian theo dõi: 8 tuần.

3.3.2. Nội dung 2: Đánh giá chất lượng cây lan gấm trong quy trình khảo sát

Sơ đồ chiết cao toàn phần:

+ 20 ml dung dịch Methanol 80%

Sóng âm

Cô quay áp quất thấp

Bã

Dịch chiết

Cao toàn phần

Bột lan gấm

3.3.2.1. Đánh giá hàm lượng phenolic trong cây lan gấm

Định lượng hàm lượng hợp chất phenolic bằng phương pháp UV-vis:

Hóa chất và thiết bị:

Dung dịch Folin-Ciocalteu, Na2CO3 10 %, máy đo quang phổ UV-vis.

Cách tiến hành: Hàm lượng phenolic tổng được xác định thông qua phương pháp

Folin - Ciocalteu. Xây dựng đường chuẩn phenolic với chất chuẩn trong khoảng nồng

độ từ 0,0625 - 1 (mg/ml) là acid gallic.

Quy trình đánh giá hàm lượng phenolic tổng:

Giữ 4 phút

+ 2 ml Na2CO3 10%

Giữ 2 giờ, nhiệt độ 25 oC

0,5 ml mẫu

2,5 ml Folin - Ciocalteu

Hỗn hợp 1

Đo mật độ quang tại bước sóng 760 nm

Hỗn hợp 2

Giải thích quy trình:

Lan gấm sau khi thu được mang đi sấy cho đến khối lượng không đổi (sau 3 ngày)

rồi nghiền thành bột.

Thêm vào bột 20 ml dung dịch Methanol 80% tạo thành dung dịch hỗn hợp. Đưa

hỗn hợp trên vào máy tạo sóng âm trong 30 phút. Lặp lại 4 lần, mỗi lần thêm 20 ml

dung dịch Methanol 80% vào trong dung dịch hỗn hợp trước đó. Thu được dịch

chiết.

Dịch chiết được cô quay áp suất thấp tạo thành cao toàn phần. Cao toàn phần này

được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa và hàm lượng phenolic tổng

trong mẫu nghiên cứu.

Acid gallic được sử dụng như là chất chuẩn và kết quả được biểu diễn:

Số miligam acid gallic/1 gam mẫu nguyên liệu

Thuốc thử Folin-Ciocalteu là một hỗn hợp của natri volframat và natri molybdat

khi có mặt phenol sẽ xảy ra phản ứng oxy hóa - khử, các nhóm -OH trong phenolic sẽ

được chuyển thành nhóm quinol tạo thành phức hợp có màu.

3.3.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trong cây lan gấm

Phương pháp: Thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

Cách tiến hành:

+ methanol thành 5 dãy nồng độ 0,156; 0,3125; 0,625; 1,25 và 2,5.

+ 100 µl dung dịch DPPH 300 µM

+ Lắc nhẹ và ủ 37 oC, trong 30 phút.

Giải thích quy trình:

Lấy 0,5 ml dịch chiết hoặc dung dịch acid gallic chuẩn có nồng độ từ 0,0625;

0,125; 0,25; 0,5; 1 (mg/ml).

Thêm vào 2,5 ml Folin-Ciocalteu (Folin phải được pha loãng ra khoảng 20 lần), lắc

đều, cho hỗn hợp phản ứng trong 4 phút.

Thêm vào hỗn hợp 2ml dung dịch Na2CO3 10%, lắc đều rồi để yên trong 2 giờ ở

25oC. Độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng được đo ở bước sóng 760 nm.

Cao toàn phần

Dung dịch mẫu

Đo OD (517 nm)

Hoạt tính chống oxy hóa của lan gấm được xác định thông qua phản ứng bao

vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela và ctv

(2003). Dựa trên nguyên tắc 2,2 - diphenyl - 1 - picrylhidrazyl (DPPH) là một gốc tự do,

có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt của chất chống

oxy hóa, DPPH bị khử thành 2,2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazine (DPPH-H) có màu

vàng. Đo kết quả sau phản ứng ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc

DPPH của chất chống oxy hóa.

Giá trị IC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất

thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử sẽ được xác

định nhờ vào phần mềm TableCurve 2Dv4.. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử

gốc tự do DPPH (khả năng kháng oxy hóa) càng cao và ngược lại.

3.4. Xử lí số liệu

Các số liệu thí nghiệm được thu nhận xử lí bằng microsoft excell 2010 và thống

kê bằng phần mềm Minitab 16 với độ tin cậy p ≥ 95%.

Giải thích quy trình:

Pha loãng cao chiết trong methanol thành 5 dãy nồng độ 0,156; 0,3125; 0,625;

1,25 và 2,5 (mg/ml).

Dung dịch ascorbic acid 200 µg/ml được sử dụng làm chất đối chứng dương.

Methanol là chất đối chứng âm.

Chuẩn bị đĩa 96 giếng, mỗi giếng bỏ vào 100 µl mẫu thử hoặc chất đối chứng, thêm

vào 100 µl dung dịch DPPH 300 µM (mỗi mẫu lặp lại 2 lần). Lắc nhẹ và ủ ở 37oC

trong 30 pht. Sau đó đem đi đo mật độ quang học ở bước sóng 517 nm trên máy

đọc ELISA.

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Ảnh hưởng của các hệ thống môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm.

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng các yếu tố môi trường vật lý có ảnh

hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong vi nhân giống.

Ngoài các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm có ảnh hưởng đến sự tăng

trưởng và quang hợp của cây con trong ống nghiệm, còn có các tác động của các yếu

tố như trạng thái môi trường nuôi cấy đối với sự phát triển của cây con.Trong nuôi cấy

in vitro thế bào thực vật, chất liệu của hệ thống nuôi cấy tác động qua lại lên sự sinh

trưởng và phát triển của cây trồng. Trong nghiên cứu này, vai trò của các loại hệ thống

nuôi cấy và trạng thái môi trường nuôi cấy được nghiên cứu nhằm đánh giá tác động

lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm ở điều kiện in vitro.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy và trạng thái môi trường lên sự sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm

Bình

nuôi

Môi

trường

Chiều cao

cây (cm)

Diện tích

lá (cm2)

Khối lượng

tươi (g)

Khối lượng

khô (g)

Hàm lượng

chlorophyll

tổng (mg/g)

Chai

Agar

4,460b

1,138b

0,516c

0,066b

1,474c

Lỏng

6,133a

1,667a

1,088ab

0,153a

3,219a

Bịch

Agar

4,840b

1,151b

0,692c

0,076b

2,278b

Lỏng

6,840a

1,921a

1,379a

0,172a

3,636a

Hộp

Agar

4,220b

0,729b

0,502c

0,053b

0,556d

Lỏng

6,293a

1,163b

0,831b

0,098b

2,562b

P-value

***

Các mẫu kí tự khác nhau (a,b, …) biểu thị sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng

Tukey’s test. ***: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,001.

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy sự phát triển của các mẫu cấy qua các thí

nghiệm có sự khác biệt rõ rệt giữa trạng thái môi trường và các bình nuôi cấy. Sau 8

tuần nuôi cấy, các mẫu cấy trên môi trường lỏng phát triển vượt trội hơn hẳn so với

các mẫu cấy trên môi trường thạch agar. Môi trường lỏng giúp thực vật được tiếp xúc

với nhiều dưỡng chất dễ hơn so với môi trường rắn. Tốc độ tăng trưởng của cây được

nuôi cấy trong môi trường lỏng cao hơn cây được nuôi cấy trong môi trường rắn nhờ

hệ quả của sự khuếch tán của nước và chất dinh dưỡng, sự tiếp xúc gần hơn giữa mẫu

cấy và môi trường giúp cây lan gấm dễ dàng hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi

trường. Môi trường nuôi cấy lỏng còn ảnh hưởng tới sự phát triển hình thái, chẳng hạn

như sản xuất mô phân sinh và phát sinh phôi soma, gip tăng trưởng về hình dạng,

kích thước và số lượng tăng trưởng tế bào (Ascough, 2004). Một ưu điểm khác của

việc sử dụng hệ thống chất lỏng cho nuôi cấy là sự giảm sự ảnh hưởng xấu của độc tố.

Bất kỳ chất chuyển hóa nào được giải phóng vào môi trường từ mẫu cấy có thể gây ức

chế hoặc gây độc đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây. Đối với môi trường rắn

nơi xuất hiện các độc tố vẫn ở xung quanh mẫu cấy (xung quanh gốc mẫu cấy hóa

đen). Trong môi trường lỏng các độc tố sẽ nhanh chóng bị pha loãng từ đó giảm tác

dụng ức chế lên cây.

Tương tự với kết quả nghiên cứu của Ascough và Fennell đã chứng minh được

sự tăng trưởng của chồi, rễ và phôi soma của thực vật trong nuôi cấy lỏng là tốt hơn.

Cũng trong nghiên cứu của Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) đã chứng minh được

môi trường lỏng có tác tác động tích cực hơn môi trường agar trong sự sinh trưởng và

phát triển của cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume.

Hình 4.1 Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy và trạng thái môi trường lên sự sinh

trưởng và phát triển của cây lan gấm. a, a1, a2: Hệ thống nuôi cấy chai tủy tinh - agar.

b, b1, b2:Hệ thống nuôi cấy chai thủy tinh - lỏng. c, c1, c2: Hệ thống nuôi cấy bịch -

agar. d, d1, d2: Hệ thống nuôi cấy bịch - lỏng. e, e1, e2: Hệ thống nuôi cấy hộp - agar.

f, f1 ,f2: Hệ thống nuôi cấy hộp - lỏng.

Loại bình nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất rõ rệt tới chất lượng cây. Về các chỉ tiêu

khi được nuôi cấy trong các hệ thống nuôi cấy cho các kết quả khác nhau, các cây to

khỏe, nhiều đốt và nhiều chồi do hàm lượng chlorophyll cao nên việc hấp thu năng

lượng từ ánh sáng tốt hơn dẫn tới năng lượng nuôi dưỡng và dự trữ dưới dạng

carbonhydrat (đường) cũng cao hơn. Thông thường sự sinh trưởng của cây bị ảnh

hưởng bởi chất lượng ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, không khí trong bình nuôi cấy. Những

yếu tố này có quan hệ mật thiết với chất liệu cấu thành hệ thống nuôi cấy, khả năng

truyền sáng cao nhất là bịch nylon, tiếp đến và chai thủy tinh và sau cùng là hộp sigma.

Cây được nuôi cấy trong túi nylon cho sinh trưởng chiều cao cây, diện tích lá, khối

lượng tươi, khối lượng khô, hàm lượng chlorophyll tổng cao nhất, tiếp đến là nuôi

trong bình thủy tinh và cuối cùng là trong hộp nhựa sigma. Khảo sát về các chu kỳ

sáng khác nhau (Dương Tấn Nhựt, 2009) đã cho thấy tác động của khoảng nhiệt độ

chênh lệch giữa các chu kỳ sáng và tối lên độ dài lóng cây in vitro ở nhiệt độ thấp.

Bình thủy tinh vốn có thành dày hơn hộp nhựa sigma và mỏng nhất là túi nylon.

Trong quá trình cây hấp thu ánh sáng, bình thủy tinh sẽ hấp thụ một phần ánh sáng

và giữ lại dẫn đến nhiệt độ trong bình thủy tinh nóng hơn trong bịch nylon và hộp

nhựa sigma. Độ ẩm tương đối cũng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến cây con

in vitro, độ ẩm cao cây phát triển chậm. Tanaka và cộng sự (1992) cho thấy rằng cây

con phát triển dưới điều kiện độ ẩm tương đối thấp, hơn nữa độ ẩm thấp sẽ tránh được

hiện tượng ng nước. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt (2009) cho thấy khả năng ht

ẩm của polyethylene là 5,8 (g/m2) cao hơn so với loại vật liệu nhựa polypropylene (vật

liệu cấu tạo nên hộp nhựa sigma) còn bình thủy tinh thì không hút ẩm, do đó độ ẩm

trong bịch nylon luôn thấp hơn so với hộp sigma và độ ẩm cao nhất ở trong bình thủy

tinh. Độ ẩm càng cao cây càng phát triển chậm, khi ẩm độ tương đối tăng cao cây

trồng phản ứng lại với môi trường và thích nghi với điều kiện ẩm độ cao, kết quả chức

năng đóng mở của khí khổng dựa trên sức trương của tế bào theo hàm lượng nước mất

đi ảnh hưởng tới quá trình hấp thu ánh sáng và phát triển của cây. Ngoài ra khả năng

thẩm thấu O2, N2 và CO2 của polyethylene tốt hơn polypropylene, tăng khả năng

quang hợp cho lan gấm. Do đó nuôi cấy lan gấm trong hệ thống nuôi cấy bịch nylon

cho kết quả tốt nhất.

Khi kết hợp hai yếu tố trạng thái môi trường và hình thái bình nuôi cấy lại với

nhau, kết quả cho thấy sự sinh trưởng của cây lan gấm đạt kết quả cao nhất ở nghiệm

thức bằng bịch nylon và môi trường lỏng với các chỉ tiêu chiều cao cây, diện tích lá,

khối lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng chlorophyll tổng đạt lần lượt là 6,840

cm; 1,921 cm2; 1,379 g; 0,172 g; 3,636 mg/g. Nghiệm thức nhận được đầy đủ ánh sáng

từ bên ngoài, độ ẩm tương đối thấp, môi trường lỏng giúp cho mẫu hấp thu các chất

dinh dưỡng tốt nhất dẫn tới mẫy lan gấm phát triển tốt hơn. Cây lan gấm được nuôi

cấy bằng hộp sigma với môi trường thạch agar có sự tăng trưởng thấp nhất. Các chỉ

tiêu tăng trưởng đạt như sau: chiều cao cây 4,220 cm, diện tích lá 0,729 cm2, khối

lượng tươi 0,502 g, khối lượng khô 0,053 g và hàm lượng cholorophyll 0,556 mg/g.

Trong nghiệm thức này cây không nhận được đầy đủ ánh sáng do hộp sigma sau khi

nhấp nhiều lần có phần bị đục và trong được trong như bịch nylon hay bình thủy tinh,

mặt khác môi trường agar gây cản trở một phần trong quá trình hấp thu các chất dinh

dưỡng từ môi trường, dẫn tới mẫu cây không có sự phát triển mạnh. Trong nghiên cứu

này, chúng tôi chọn được ra hệ thống nuôi cấy cây lan gấm tối ưu nhất là hệ thống

nuôi cấy bằng túi nylon kết hợp môi trường lỏng là tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát

triển của cây lan gấm.

4.2. Ảnh hưởng của các hệ thống đèn chiếu sáng đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của cây lan gấm.

Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật sử dụng nguồn

chiếu sáng là đèn huỳnh quang, không những tiêu tốn nhiều điện năng, phát nhiệt, tuổi

thọ thấp mà đèn huỳnh quang còn phát ra những bước sóng không cần thiết cho sự

sinh trưởng của thực vật (Kim và ctv, 2004). Vì vậy, ánh sáng đơn sắc LED là một

nguồn năng lượng mới cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình

tăng trưởng sinh học nhờ vào những ưu điểm như kích thước và thể tích nhỏ, tuổi thọ

cao, cấu trc đặc, an toàn và vùng quang phổ được kiểm soát (Nhut và ctv, 2002).

Các chỉ tiêu ghi nhận tác động của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của

cây lan gấm được trình bày trong bảng 4.2.

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của các hệ thống đèn chiếu sáng lên sự sinh trưởng và phát triển

của cây lan gấm

Hệ thống đèn

Chiều cao

cây (cm)

Diện tích

lá (cm2)

Khối lượng

tươi (g)

Khối lượng

khô (g)

Hàm lượng

chlorophyll

tổng (mg/g)

Led

7,853a

2,181a

1,764

0,243a

4,747a

Huỳnh Quang

6,733b

1,637b

1,371

0,150b

4,041b

P-value

***

Các mẫu kí tự khác nhau (a,b) biểu thị sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng

Tukey’s test. *: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05; ***: các biệt có ý nghĩa ở mức p ≤

0,001; ns (non significant): p > 0,05 không có sự khác biệt về mặt thống kê.

Sử dụng hệ thống nuôi cấy tối ưu nhất của thí nghiệm 1 kết hợp với hệ thống

chiếu sáng đèn led và đèn huỳnh quang. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nghiệm thức sử

dụng hệ thống chiếu sáng đèn LED cho kết quả chiều cao cây đạt trung bình 7,853 cm,

diện tích lá đạt 2,181 cm2, khối lượng tươi 1,764 g, khối lượng khô 0,243 g và hàm

lượng chlorophyll tổng 4,747 mg/g. Trong khi mẫu nghiên cứu dưới hệ thống ánh sáng

đèn huỳnh quang lại cho kết quả thấp hơn cụ thể là chiều cao cây 6,733 cm, diện tích

lá 1,637 cm2, khối lượng tươi 1,764 g, khối lượng khô 0,150 g và hàm lượng

chlorophyll ở mức 4,041 mg/g.

Trong điều kiện nuôi cấy vi nhân giống, ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến quá

trình phát triển của cây in vitro, cường độ dòng photon quang hợp có vai trò quan

trọng trong quá trình sinh trưởng và quang hợp ở nhiều loài thực vật (Cui và ctv, 2000;

Kozai và ctv, 1997). Chất lượng ánh sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình

quang phát sinh hình thái, quang hợp và tổng hợp protein (Wang và ctv, 2001), ảnh

hưởng đến sinh tổng hợp chlorophyll (Tripathy, Brown, 1995). Sự sinh trưởng của

thực vật biểu hiện qua các mức độ sinh lý, hình thái khác nhau dưới các vùng quang

phổ khác nhau (Barreiro và ctv, 1992).

Sự sinh trưởng và phát triển của thực vật biểu hiện qua các mức độ, sinh lí, hình

thái và giải phẫu khác nhau dưới các vùng quang phổ khác nhau. Ánh sáng đỏ có vai

trò quan trọng trong quang hợp và tổng hợp tinh bột ở thực vật, ánh sáng xanh lại thể

hiện vai trò trong hình thành chlorophyll, phát triển lục lạp, đóng mở khí khổng và

quang phát sinh hình thái. Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng đến cấu trúc lá. Hầu hết các

nguồn chiếu sáng sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật đều sử dụng

đèn huỳnh quang một loại đèn phổ biến trong nghiên cứu nuôi cấy mô. Tuy nhiên,

vùng quang phổ phát ra từ chúng rất rộng, không phải là ngưỡng thích hợp ở một số

loài thực vật. Và đèn LED phát triển như nguồn chiếu sáng chính cho cây trồng bởi

chng có bước sóng xác định. Đèn LED đã được sử dụng trong các nghiên cứu quang

sinh học bao gồm tổng hợp chlorophyll, quang hợp và quang phát sinh hình thái.

Một vài nghiên cứu đã thành công khi ứng dụng hệ thống chiếu sáng đơn sắc

trong sinh trưởng và phát triển cây trồng. Tanaka và cộng sự (1998) đã cho thấy sự

sinh trưởng lá, hàm lượng chlorophyll, trọng lượng chồi và rễ đều có ảnh hưởng khi

cây Địa lan in vitro sinh trưởng dưới ánh sáng đèn LED. Dương Tấn Nhựt và đồng tác

giả (2003) cũng đã chứng minh được cây Dâu tây in vitro phát triển tốt nhất khi được

nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED với cường độ chiếu sáng là 60 µmol/m2.s. Jao

và đồng tác giả (2005) nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED lên sự sinh

trưởng và hình thành thân của cây Zantedeschia. Trong nghiên cứu của Heo và đồng

tác giả (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED, cây Nho tăng khả năng

sinh trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp như carbonhydrate. Kết quả của nghiên

cứu này cũng cho thấy, các chỉ tiêu từ chiều cao cây, diện tích lá, khối lượng tươi, khối

lượng khô và hàm lượng chlorophyll đều có sự khác biệt rất có ý nghĩa dưới điều kiện

chiếu sáng LED đỏ kết hợp LED xanh so với ánh sáng đèn huỳnh quang.

Hình 4.2 Ảnh hưởng của các hệ thống đèn chiếu sáng lên sự sinh trưởng và phát triển

của cây lan gấm. l, l1, l2: hệ thống nuôi cấy bịch-lỏng-huỳnh quang. h, h1, h2: hệ

thống nuôi cấy bịch-lỏng-led.

4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của cây lan gấm từ quy trình nuôi cấy

4.3.1. Xác định hàm lượng phenolic trong cây lan gấm

Lan gấm là một loại lan dược liệu chứa hàm lượng phenolic cao và trong thí

nghiệm này hàm lượng phenolic được đánh giá thông qua hàm lượng polyphenol tổng

trong cây lan gấm nuôi trồng in vitro để có những đánh giá chính xác hơn. Hàm lượng

polyphonel tổng số được xác định dựa theo đường chuẩn gallic acid (số liệu đường

chuẩn trình bày trong phụ lục). Kết quả nồng độ acid gallic trong các cao chiết lan gấm

được trình bày trong bảng 4.5 và 4.6.

Bảng 4.5 Kết quả nồng độ acid gallic trong các cao chiết lan gấm ở thí nghiệm 1

Bình nuôi

Môi trường

Hàm lượng phenolic (mg GAE/g)

Chai

Agar

20,1348

Lỏng

23,8427

Bịch

Agar

21,2022

Lỏng

26,3146

Hộp

Agar

19,9660

Lỏng

22,5506

Hàm lượng phenolic trong tất cả các cao chiết lan gấm từ các nghiệm thức

nghiên cứu là khác nhau. Trong thí nghiệm 1, hàm lượng phenolic của cây lan gấm đạt

mức cao nhất khi sử dụng hệ thống nuôi cấy bịch nylon kết hợp môi trường lỏng, chỉ

số phenolic đạt 26,3146 (mg GAE/g). Giữa hàm lượng phenolic và sự phát triển của

mẫu cây có mối liên hệ với nhau. Điều kiện sinh trưởng của cây càng tốt dẫn đến cây

càng phát triển mạnh, do đó khả năng quang tự dưỡng của cây cao do đó các hợp chất

thứ cấp được cây sản sinh ra với hàm lượng cao hơn.

Bảng 4.6 Kết quả nồng độ acid gallic trong các cao chiết lan gấm ở thí nghiệm 2

Hệ thống đèn

Hàm lượng phenolic (mg GAE/g)

Led

31,2022

Huỳnh quang

28,3370

Thực hiện nghiệm thức tối ưu nhất của thí nghiệm 1 trong hệ thống nuôi cấy đèn

led và đèn huỳnh quang cho kết quả rất khả thi. Cụ thể hàm lượng phenolic của cây lan

gấm được nuôi cấy trong hệ thống chiếu sáng đèn huỳnh quang đạt 28,3370 (mg

GAE/g) trong khi nuôi cấy trong hệ thống chiếu sáng đèn led đạt 31,2022 (mg

GAE/g). Dưới điều kiện chiếu sáng đèn led cây sinh trưởng mạnh hơn do đó hàm

lượng phenolic được sản sinh ra nhiều hơn. Điều này cho thấy các hệ hống nuôi cấy

cho cây năng suất cao, chất lượng tốt thì quá trình tổng hợp carbohydrate mạnh. Trong

khi đó carbohydrate là thành phần quan trọng của bộ khung tế bào và là thành phần

cấu tạo nên các hợp chất thứ cấp ở thực vật mà trong đó có phenolic. Có thể nói rằng

điều kiện nuôi cấy in vitro góp phần không nhỏ vào trong quá trình tổng hợp các hợp

chất thứ cấp ở thực vật. Cường độ chiếu sáng càng lớn thì hàm lượng phenolic càng

cao và ngược lại, vì khi nhận được ánh sáng nhiều cây chắc khỏe, khối lượng tươi cao

thì hàm lượng các hợp chất thứ cấp sẽ được tế bào sản sinh ra nhiều hơn.

4.3.2. Xác đinh hoạt tính kháng oxi hóa của cây lan gấm

Một loại chiết xuất từ cây lan gấm A. formosanus Hayata có các hoạt tính

kinsenone, phenolic và glycoside flavonoid, các hoạt tính này có khả năng chống oxy

hóa rất cao. Điều đó đồng nghĩa với khả năng miễn dịch mạnh và làm chậm quá trình

lão hóa của các tế bào trong cơ thể. Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những

phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong in vitro thường được sử dụng

nhất trong nghiên cứu, có đến 90 % các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng

phép phân tích này (Joon - Kwan và Takayuki, 2009). Năng lực khử cũng là một phép

phân tích nhằm đánh giá khả năng chống oxi hóa trong in vitro và được thế hiện qua

giá trị IC50.

Trong thí nghiệm 1, khả năng kháng oxy cuat các nghiệm thức có sự thay đổi

theo các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Giảm dần từ bịch nylong – chai thủy tinh – hộp

sigma và giảm dần từ môi trường lỏng về môi trường rắn. Giá trị IC50 thấp nhất đạt

3,12 (mg/ml) xuất phát từ nghiệm thức sử dụng hệ thống nuôi cấy bịch nylon kết hơp

môi trường lỏng. Điều này cho thấy khả năng kháng oxy hóa của lan gấm từ nghiệm

thức này là mạnh nhất. So với nghiệm thức IC50 đạt 5,689 (mg/ml) xuất phát tự

nghiệm thức sử dụng hệ thống nuôi cấy hộp sigma kết hợp môi trường rắn.

Bảng 4.3. Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết lan gấm trong thí nghiệm 1

Bình nuôi

Môi trường

IC50 (mg/ml)

Chai

Agar

5,436

Lỏng

4,239

Bịch

Agar

5,216

Lỏng

3,120

Hộp

Agar

5,689

Lỏng

5,093

Trong thí nghiệm 1, khả năng kháng oxy hóa cao nhất xuất phát từ nghiệm thức

sử dụng hệ thống nuôi cấy bịch nylon kết hợp môi trường lỏng.

Bảng 4.4. Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết lan gấm trong thí nghiệm 2

Hệ thống đèn

IC50 (mg/ml)

Led

1,939

Huỳnh quang

3,074

Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của các cây lan gấm được nuôi trồng trong

điều kiện tối ưu nhất của thí nghiệm 1, dưới hệ thống ánh sáng đèn led và dèn huỳnh

quang một lần nữa cho thấy ánh sáng đèn led có tác dụng mạnh mẽ lên khả năng

kháng oxy hóa của cây hơn so với ánh sáng đèn huỳnh quang. Chỉ số IC50 trong hệ

thống ánh sáng đèn led đạt 1,939 (mg/ml) thấp hơn rất nhiều so với chỉ số IC50 trong

hệ thống ánh sáng đèn huỳnh quang là 3,074. Điều này cho thấy khả năng kháng oxy

hóa của các cây lan gấm được nuôi cấy dưới hệ thống chiếu sáng đèn led có khả năng

kháng oxy hóa cao hơn gấp 158% so với các cây được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn

huỳnh quang.

Giữa hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ cao

chiết lan gấm có mối tương quan với nhau khá chặt chẽ. Oxy hóa là quán trình giết

chết tế bào, còn phenolic lại là một chất có khả năng kháng lại quá trình oxy hóa. Do

đó tỉ lệ phenolic càng nhiều thì khả năng kháng oxy hóa càng cao, gip tế bào không

bị oxy hóa. Kháng oxy hóa là một trong những đặc tính sinh hoc quan trọng nhất của

polyphenol hay dịch chiết lan gấm. Khả năng này gắn liền với tiềm năng lợi ích của

polyphenol lan gấm với sức khỏe con người.

Nghiên cứu của Gruz và cộng sự (2011) trên quả sơn trà cho thấy hàm lượng

polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa có mối liên quan đến nhau trong đó khả năng

chống oxi hóa của quả sơn trà phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol. Theo Abdullah

và cộng sự (2012) tổng hàm lượng phenolic của dịch chiết xuất từ nấm ăn có liên quan

với nhau. Giữa hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hoá có mối tương quan

tuyến tính khá chặt chẽ. Điều này cho thấy các hợp chất polyphenol có thể đóng vai trò

chính đối với hoạt tính chống oxi hoá của các loại nấm nghiên cứu.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả công bố bởi Truong và ctv (2007). Cũng

từ kết quả này cho thấy polyphenol là thành phần chính góp phần tạo nên khả năng

chống oxi hóa của các thực vật được tuyển chọn trong nghiên cứu.

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

Trong nghiên cứu này đã xác định được hệ thống nuôi cấy tốt nhất cho sự sinh trưởng

và phát triên của cây lan gấm:

- Hệ thống môi trường nuôi cấy bịch nylon trên nền môi trường lỏng là tốt nhất

cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm.

- Hệ thống chiếu sáng đèn led là tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây

lan gấm.

- Hệ thống nuôi cấy chung môi trường lỏng - bịch nylon - đèn led là tốt nhất cho

sự sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm.

- Cao chiết lan gấm trong hệ thống nuôi cấy môi trường lỏng - bịch nilon - đèn

led có làm hượng phenolic cao vượt trội hơn hẳn các hệ thống nuôi cấy còn lại.

- Khả năng kháng oxy hóa trong hệ thống nuôi cấy môi trường lỏng - bịch nilon -

đèn led là cao nhất với giá trị IC50 là 1,939 cao hơn gấp 2,8 lần khi nuôi cấy

trong hệ thống nuôi cấy thông thường môi trường rắn - chai thủy tinh - đèn

huỳnh quang với giá trị IC50 là 5,436.

Đề nghị

Từ các kết quả đạt được trong nghiên cứu này, một số hướng nghiên cứu được đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần Tiếng Việt

1. Chính Phủ Nước cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam. 2006. Nghị định số 32 /

2006 / NĐ – CP.

2. Dương Công Kiên. 2003. Nuôi cấy mô thực vật, tập 1,2,3. Nhà xuất bản Đại Học

Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh.

3. Dương Tấn Nhựt. 2009. Công nghệ Sinh học Thực vật, tập 2. Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh.

4. Dương Tấn Nhựt. 2011. Công nghệ Sinh học Thực vật, tập 3. Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh.

5. Đỗ Đăng Giáp. 2016. Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối cây lan gấm

(Anoectochilus formosanus Hayata) có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô trên môi trường lỏng. Đề tài phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về Công

nghệ tế bào thực vật - Viện Sinh học nhiệt đới TpHCM.

6. Đỗ Đức Thăng. 2018. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy nhân nhanh sinh khối cây lan

gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) trong Bioreactor. Luận văn Thạc sĩ Công

nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

7. Đỗ Mạnh Cường, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Thanh Sang,

Nguyễn Hồng Hoàng, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Xuân Tuấn, Trần Hiếu, Hoàng

Thanh Tùng, Nguyễn Thị Kim Loan và Dương Tấn Nhựt. 2015. Ảnh hưởng của

một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm

(Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học và phát triển

13 (3): 337-344.

8. Phan Xuân Hiên, Nguyễn Thị Phượng Hoàng. 2017. Nghiên cứu tái sinh chồi in

vitro và nuôi trồng cây lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata). Tạp chí công

nghệ sinh học 15 (3): 515-524.

Phần tiếng nước ngoài

9. Ahmed R.G. 2005. Is there a balance between oxidative stress and antioxidant

defense system during development. Medical Journal of Islamic World Academy

of Sciences 15: 55-63.

10. Anon. 1999. Anoectochilus formosanus Hayata. Zhonghua Bencao Vol. 8.

Shanghai Science Technology Press, Shanghai, pp: 672-673.

11. Ascough G.D., and C.W Fennell. 2004. The regulation of plant growth and

development in liquid culture. South African Journal of Botany 70(2): 181-190.

12. Cavestro W. 1994. Cultivating Anoectochilus, Dossinia, Macodes and other jewel

orchids. American Orchid Society Bulletin 63: 1387-1389.

13. Chan C.C., Hou C.L., Chung C.H., and W.T. Liu. 1994. Evaluation of an in vitro

virus culture system for anti-virus study of the Chinese herb. J. Food Drug Anal

(2): 123-132.

14. Chow H.T., Hsieh W.C., and C.S. Chang. 1982. In vitro propagation of

Anoectochilus formosanus. Journal of Science and Engineering 19: 155-165.

15. Chiu N.Y., and K.H. Chang. 1995. The Illustrated Medicinal Plants of Taiwan.

Taipei, Taiwan, China. SMC Publishing Inc 4: 282-283.

16. Chung H.H., Shi S.K., Huang B., and J.T Chen. 2017. Enhanced Agronomic Traits

and Medicinal Constituents of Autotetraploids in A.formosanus Hayata, a Top-

Grade Medicinal Orchid. Molecular journal of Published online 22(11): 1907-

1908.

17. Cui Y.I., Hahn J., Kozai T., and K.Y. Paek. 2000. Number of air exchanges, sucrose

concentration, photosynthetic photon flux, and differences in photoperiod and

dark period temperatures affect growth of Rehmannia glutinosa plantlets in vitro.

Plant Cell Tiss Org 62: 219-226.

18. Du X.M., Sun N.Y., Tamura T., Mohri A., Sugiura M., Yoshizawa T., Irino N.,

Hayashi J., and Y. Shoyama. 2001. Higher yielding isolation of Kinsenoside in

Anoectochilus and its anti-hyerliposis effect. Biol. Pharm. Bull 24: 65-69.

19. Du X.M., Yoshizawa T., and Y. Shoyama. 1998. Butanoic acid glucoside

composition of whole body and in vitro plantlets of Anoectochilus formosanus.

Phytochemistry 49: 1925-1928.

40 
 
20. Eng  Soon  Teoh.  2016.  Medicinal  Orchids  in  Asia  by  Genus  and  Species 
Introduction  to  Part  II.  Medicinal  Orchids  of  Asia.  Springer  International 
Publishing Switzerland, Switzerland, pp: 103-105. 
21. Fujiwata K., and T. Kozai. 1995. Physical  microenvironment and its effects on 
Automation and invironmental control in plant tissue culture. Kluwer Academic 
Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp: 319-369. 
22. Fujiwata K., Kozai T., and I. Watanabe. 1989. Effects of closures and vessels on 
light intensitis in plant tissue culture vessels. J. Agric. Meteorol 45 (3): 143-149. 
23. Heo  J.W., Shin  K.S.,  Kim S.K.,  and K.Y.  Paek. 2006.  Light  quality affects  in  vitro 
growth of grape ‘Teleki 5BB7’. J. Plant Biol 49: 276-280.  
24. Ho Y., Chen Y.F., Wang L.H., Hsu K.Y., Chin Y.T., Yang Y.C.S.H., Wang S.H., 
Chen Y.R., Shih Y.J., Liu L.F., Wang K., Jacqueline W.P., Tang H.Y., Lin H.Y., 
Liu  H.L.,  and  S.J.  Lin.  2018.  Inhibitory  Effect  of Anoectochilus 
formosanus Extract  on  Hyperglycemia-Related PD-L1 Expression  and  Cancer 
Proliferation. Published online of Front Pharmacol 9: 807. 
25. Hu  X.M.,  Zhang  W.K.,  and  Q.Z.  Zhu.  2000.  Zhonghua  Bencao vol.  8.  Shanghai 
Scientific and Technical Press, Shanghai. 
26. Jao R.C., Lai C.C., Fang W., and S.F. Chang. 2005. Effects of red light on the 
growth of Zantedeschia plantlets in vitro and tuber formation using light-emitting 
diodes. HortSci 40: 436-438.  
27. Joon-Kwan Moon and  Takayuki Shibamoto. 2009. Antioxidant  assays for plant 
and food components: Reviews. J. Agric. Food Chem.57: 1655-1666. 
28. Kan  W.S.  1986.  Anoectochilus  formosanus  Hayata.  In  Pharmaceutical  Botany. 
National Research Institute of Chinese Medicine, Taipei, Taiwan: 647-649.  
29. Kim  S.J.,  Hahn  E.J.,  Heo  J.W.,  and  K.Y.  Paek.  2004.  Effects  of  LEDs  on  net 
photosynthetic  rate,  growth  and  leaf  stomata  of  chrysanthemum  plantlets  in 
vitro. Sci. Hort 101: 143-151. 
30. Kozai  T.,  Fujiwara  K.,  Hayashi  M.,  and  J.  Aitken-Christie.  1992.  The  in  vitro 
environment and its control in micropropagation. Kluwer Academic Publishers, 
Dordrecht, The Netherlands, pp: 247-282. 

31. Kozai T., Kubota C., and B.R. Jeong. 1997. Environmental control for large-scale

production of plants through in vitro techniques. Plant Cell Tiss Org 51: 49-56.

32. Lin J.M., Lin C.C., Chiu H.F., Yang J.J., and S.G. Lee. 1993. Evaluation of the

anti-inflammatory and liver-protective effects of Anoectochilus formosanus,

Ganoderma lucidum and Gynostemma pentaphyllum in rats. Amer. J. Chin. Med

21: 59-69.

33. Lin W.C., and C.C. Hsieh. 2005. Commercial Application of Anoectochilus

formosanus: Immunomodulating Activities. International Journal of Applied

Science and Engineering 3(3): 175-178.

34. Lin W.C. 2007. Study of health keeping effects of Anoectochilus formosanus

Hayata. Agriculture World 288: 8-13.

35. Mak O.T., Huang D.D., and R.C.S. Law. 1990. Anoectochilus formosanus Hayata

contains substances that affect arachidonic acid metabolism. Phytotherapy

Research 4: 45-48.

36. Masuda K., Ikeuchi M., Koyama T., Yamaguchi K., Woo J.T., Nishimura T., and

K. Yazawa. 2008. Suppressive effects of Anoectochilus formosanus extract on

osteoclast formation in vitro and bone resorption in vivo. Journal of Bone and

Mineral Metabolism 26: 123-129.

37. Megdiche-Ksouri W., Trabelsi N., Mkadmini K., Bourgou S., Noumi A., and M

Snoussi. 2015. Artemisia campestris phenolic compounds have antioxidant and

antimicrobial activity. Industrial Crops and Products 63: 104-113

38. Moorhouse S.D., Wilson G., Hennerty M.J., and T.S. Mac An. 1996. A plant cell

biorector with medium-perfusion for control of somatic embryogenesis in liquid

cell suspensions. Plant Growth Regulation 20: 53-56.

39. Ormerod Paul. 2005. Notulae Goodyerinae (II). Taiwania 50 (1): 1-10.

40. Ou J.C., Hsieh W.C., Lin I.H., Chang Y.S., and T.S. Chen. 2003. The catalogue of

medicinal plant resources in Taiwan. Department of Health Taipei, Taiwan.

41. Read P.E., Ammirato P.V., Evans D.A., Sharp W.R., and Y.P.S. Bajaj. 1990.

Environmetal effects in micropropagation. Handbook of Plant Cell Culture:

Ornamental species vol. 5. McGraw-Hill, New York, pp: 95-125.

42. Reiter C.E., Kim J.A. and M.J Quon. 2010. Green tea polyphenol epigallocatechin

gallate reduces endothelin-1 expression and secretion in vascular endothelial

cells: roles for AMP-activated protein kinase, Akt and FOXO1. Endocrinology

151: 103-104.

43. Salisbury F.B. 1981. Twilight effect: Initiating dark measurement in

photoperiodism of Xanthium. Plant physol 67: 1230-1238.

44. Schwabe W.W. 1963. Morphogenetic responses to climate in Environmental

Control of Plant Growth, Academic Press, pp:311-336.

45. Shiau Y.T., Sagare A.P., Chen U.C., Yang S.R., and H.S. Tsay. 2002.

Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination

and in vitro culture of seeds. Bot. Bull. Acad. Sin. 43: 123-330.

46. Shih C.C., Wu Y.W., and W.C. Lin. 2002. Antihyperglycaemic and anti-oxidant

properties of Anoectochilus formosanus in diabetic rats. Clin Exp Pharmacol

Physiol 29(8): 684-8.

47. Takatsuki, S., J.D. Wang., Narui T., and T. Okuyama. 1992. Studies on the

components of crude drug “Kim-soan-lian”. J. Jpn, Bot 67: 121-123.

48. Takeshita, T., Tago H., Nakamura M., Muraoka S., and T Yoshizawa. 1995. Blood

Sugar Regulator and Lipid Metabolism- Improving Agent. Japanese Patent Appl

No. 05246311.

49. Tanaka M., Takamura T., Watanabe H., Endo M., Yanagi T., and K Okamoto.

1998. In vitro growth of Cymbidium plantlets cultured under superbright red and

blue light-emitting diodes (LEDs). J. Hort. Sci. Biotech 73: 39-44.

50. Teuscher H. 1978. Collector’s item: Erythyrodes, Goodyera, Haemaria and

Macodes with Anoectochilus. American Orchid Society Bulletin 47 (2): 121-129.

51. Tripathy B.C., and C.S Brown. 1995. Root-shoot interaction in greening of wheat

seedlings grown under red light. Plant Physiol 107: 407-411.

52. Tseng C.C., Shang H.F., Wang L.F., Su B., Hsu C.C., Kao H.Y., and K.T Cheng.

2005. Antitumor and immunostimulating effects of Anoectochilus formosanus

Hayata. International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology 13(5):

366-370.

53. Wang H., Ma L.G., Li J.M., Zhao H.Y., and X.M Deng. 2001. Direct interaction of

Arabidopsis crytochromes with COP1 in light control development. Science 294:

154-158.

54. Wu J.B., Lin W.L., Hsieh C.C., Ho H.Y., Tsay H.S., and W.C Lin. 2007. The

Hepatoprotective Activity of Kinsenoside From Anoectochilus Formosanus.

Phytotherapy Research 21(1): 58-61.

55. Wu K.B. 2007. The use and potential for Anoectochilus formosanus Hayata.

Agricultre World 288: 14-19.

56. Wu X.R. 1994. A concise edition of medicinal plants in China. Guangdong Higher

Education Publication House, Guangdong, China.

57. Yang L., Zhang J.C., Qu J.T., He G., Yu H.Q., Li W.C., and F.L Fu. 2019.

Expression response of chalcone synthase gene to inducing conditions and its

effect on flavonoids accumulation in two medicinal species of Anoectochilus.

Scientific Reports Journal 9: 20171.

Phụ lục

Phụ lục 1: Bảng số liệu thống kê

Bảng 1. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê chiều cao cây của thí nghiệm 1 và 2

Analysis of Variance for SC, using Adjusted SS for Tests

Bảng 2. Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao cây của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 3. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê diện tích lá của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 4. Bảng trắc nghiệm phân hạng diện tích lá của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 5. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê khối lượng tươi của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 6. Bảng trắc nghiệm phân hạng khối lượng tươi của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 7. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê khối lượng khô của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 8. Bảng trắc nghiệm phân hạng khối lượng khô của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 9. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê hàm lượng chlorophyll của thí nghiệm 1 và

Bảng 10. Bảng trắc nghiệm phân hạng hàm lượng chlorophyll của thí nghiệm 1 và 2

Bảng 11. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê chiều cao cây của thí nghiệm 3

Bảng 12. Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao cây của thí nghiệm 3

Bảng 13. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê diện tích lá của thí nghiệm 3

Bảng 14. Bảng trắc nghiệm phân hạng diện tích lá của thí nghiệm 3

Bảng 15. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê khối lượng tươi của thí nghiệm 3

Bảng 16. Bảng trắc nghiệm phân hạng khối lượng tươi của thí nghiệm 3

Bảng 17. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê khối lượng khô của thí nghiệm 3

Bảng 18. Bảng trắc nghiệm phân hạng khối lượng khô của thí nghiệm 3

Bảng 19. Bảng ANOVA kết quả xử lí thống kê hàm lượng chlorophyll của thí nghiệm 3

Bảng 20. Bảng trắc nghiệm phân hạng hàm lượng chlorophyll của thí nghiệm 3

Phụ lục 2: Đường chuẩn

Bảng 2.1.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 1

Bảng 2.1.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 1

Hình 2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 1

Bảng 2.2.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 2

Bảng 2.2.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 2

Hình 2.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 2

Bảng 2.3.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 3

Bảng 2.3.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 3

Hình 2.3. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 3

Bảng 2.4.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 4

Bảng 2.4.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 4

Hình 2.4. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 4

Bảng 2.5.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 5

Bảng 2.5.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 5

Hình 2.5. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 5

Bảng 2.6.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 6

Bảng 2.6.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 6

Hình 2.6. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 6

Bảng 2.7.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 7

Bảng 2.7.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 7

Hình 2.7. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 7

Bảng 2.8.a. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 8

Bảng 2.8.b. Hoạt tính chống oxy hóa của nghiệm thức 8

Hình 2.8. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của nghiệm thức 8

Bảng 2.9. Số liệu đường chuẩn polyphenol

Hình 2.9. Đồ thị đường chuẩn acid gallic

Bảng 2.10. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 1

Bảng 2.11. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 2

Bảng 2.12. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 3

Bảng 2.13. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 4

Bảng 2.14. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 5

Bảng 2.15. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 6

Bảng 2.16. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 7

Bảng 2.17. Nồng độ acid gallic của nghiệm thức 8

Phụ lục 3: Thành phần môi trường MS

Khoáng đa lượng

Khoáng vi lượng